Становлення музею відбувалося у нерозривному зв’язку із процесом відродження Острозької академії, новий етап історії якої розпочався 12 квітня 1994 року після Указу Президента Леоніда Кравчука «Про утворення Острозького колегіуму». Ідея заснування музею університету належить Петру Зотовичу Андрухову, одному з ініціаторів відродження Острозької академії. Саме він очолив Центр вивчення спадщини Острозької академії і розпочав збір матеріалів для створення експозиції, що і стало початком створення музею. Після того, як життя Петра Зотовича раптово обірвалось, його справу продовжила Бондарчук Ярослава Віталіївна. За час її роботи на посаді директора центру (1997-2006 рр.) була сформована експозиція, присвячена історії навчального закладу, яка розпочала роботу 1 вересня 1997 року. Через відсутність автентичних артефактів та архіву академії періоду XVI-XVIІ ст., Ярослава Віталіївна провела тривалу пошукову та наукову роботу і відтворила навчальний процес в академії та життя Острога XVI ст. за допомогою копій архівних документів та муляжів. Згодом експозиція історії Острозької академії поповнилась цікавими археологічним матеріалом, а пізніше – поступово доповнювалася експонатами, що стосувались життя відродженого університету.
З перших днів роботи Острозька академія ставила за мету відродження та збереження не лише давніх українських освітніх традицій, але й історичної пам’яті в цілому. Відроджений навчальний заклад розташувався в приміщеннях, які мали неперервну історію функціонування, починаючи з XVIII ст. В різний час вони виконували різні функції: католицького монастиря капуцинів, жіночого училища імені графа Дмитра Блудова, вчительської семінарії, педагогічного училища, школи інтернату та ін.
Ректорат академії всіляко сприяв збереженню та відновленню найстарішої частини приміщень (комплексу монастиря капуцинів XVIII – поч. ХІХ ст.), які за висновками експертної комісії були в незадовільному стані. В 1997 році розпочалися ремонтні роботи будівлі храму XVIII ст., який, після тривалої реставрації, був освячений у 2005 році. За цей період (з 1999 року) в університеті було розпочато процес формування іконописної колекції, яку розмістили у відреставрованому храмі. Колекція систематично поповнюється, завдяки випускникам академії та меценатам. В основі зібрання – зразки українського та європейського іконопису XVIII -ХІХ ст., також твори відомого сучасного живописця Юрія Нікітіна та випускників Національної академії образотворчого мистецтва та архітектури (м Київ). Ікони, будучи експонатами музею академії, водночас, є частиною інтер’єру храму, і в комплексі з ним створюють експозиційний розділ музею університету.
Протягом 1998-1999 рр. силами працівників та студентів вдалося розчистити підземелля, що розташовуються під храмом і в період функціонування монастиря використовувались як крипти (місця поховань). Оскільки поховання були знищені і розграбовані в ХІХ ст., в процесі розчистки було віднайдено велику кількість людських кісток. Їх було перепоховано, відтворено інтер’єр крипт, а приміщення музеєфіковано. Підземелля стали частиною музейного комплексу.
В 2000 році у старомонастирському корпусі (колишній корпус келій XVIII ст.) була сформована експозиція історії приміщень, в яких функціонує сучасна Острозька академія. Центральним експонатом цієї зали стала віднайдена та відреставрована монастирська криниця.
З кожним роком експозиції розширювались, збільшувалась кількість експонатів. Завдяки меценатам, спонсорам та друзям Острозької академії, музей університету поповнився великою кількістю рідкісних книг, стародруків, картин українських художників, пам’ятних та ювілейних монет, тощо. Це дало змогу сформувати декілька тематичних експозицій та цілу низку колекцій.
У 2007 році на ректораті було прийнято рішення переформатувати Центр вивчення спадщини Острозької академії та виокремити Музей в підрозділ університету, що сприяло його розвитку і розширенню. За часу перебування на посаді директора Музею Світлани (Дарчик) Муравської (2006-2010 рр.) було налагоджено фондову роботу, частково оновлено експозиції, проведено державну реєстрацію музею. Так, музейний комплекс НаУОА набув статусу музею при ЗВО.
Протягом 2005-2014 рр. в музеї сформовано експозицію стародруків та рідкісних книг, яка декілька раз змінювалася і доповнювалася. З 2014 року колекція розташована в захристі студентсько-викладацького храму. Тут представлені видання найбільших українських друкарень XVI – XVIII ст. (Львівської, Київської, Почаївської), а також раритетні книги ХІХ – поч. ХХ ст.
Художній фонд музею формується з 1997 року і станом на 2019 рік налічує понад 600 одиниць зберігання. Це, переважно, живописні роботи сучасних українських художників, а також скульптури, художній текстиль та скло. Більшість картин представлені в тематичних колекціях та експонуються у коридорах центрального корпусу НаУОА.
У 2011-2015 рр. в музеї університету з’явилися роботи всесвітньо відомих скульпторів українського походження Міртали Кардиналовської-Пилипенко та Петра Капшученка. Відома американська мисткиня Міртала подарувала університету 15 своїх скульптурних робіт, виконаних в бронзі. Колекція робіт українського скульптора діаспори Петра Капшученка сформувалася завдяки благодійниками зі США – Брониславі Скорупській та подружжю Олександра та Раїси Михалюків. На сьогодні скульптури перебувають в постійній експозиції, а музей репрезентує їх та знайомить відвідувачів із творчістю видатних митців українського зарубіжжя.
З 2009 року розпочав роботу найбільш динамічний експозиційний підрозділ музею – підземна мистецька галерея, розташована в підвальних приміщеннях, колишнього монастиря капуцинів XVIII ст. Для проведення виставок та мистецьких подій налагоджено активну співпрацю з регіональними спілками художників України, окремими митцями та колекціонерами, музеями та галереями України. Протягом 10 років у галереї було організовано понад 80 виставок, систематично проводяться зустрічі з митцями, відкриті лекції, презентації, вечори поезії тощо.
Окремим експозиційним підрозділом музею є приватна етнографічна колекція та збірка рідкісних книг відомого українського вченого, академіка Миколи Жулинського. Передані благодійником речі представлені в окремо експозиції, сформованій у 2014 році. Працівниками музею було започатковано постійно діючі експозиції, які сформувались та поповнюються за результатами студентських практик. Це – етнографічна та археологічна колекції, що містить виключно матеріал, зібраний студентами в рамках практики, опрацьований ними в навчальних та наукових цілях і служить методичною базою у навчальному процесі університету.
В 2011 році, відповідно до наказу Міністерства освіти і науки, молоді та спорту України № 317 (від 08.04.2011 р.) Музею історії НаУОА присвоєно звання «Зразковий музей». 25 грудня 2014 року університетський музей отримав звання «Народний».
У 2021 році Музей НаУОА реалізував грантовий проект від Українського культурного фонду «Острозька академія: 445 років історії вищої освіти в Україні». За підсумками проекту було кардинально переосмислено та оновлено ключову експозицію музею, присвячену історії Острозької академії. Частково було оновлено та розширено також експозицію, присвячену історії приміщень, у яких нині функціонує університет. Музейний комплекс розміщено у найстаріших будівлях – старомонастирському корпусі НаУОА.
Сучасний Музей історії Острозької академії помітно відрізняється від інших університетських музеїв. В його комплекс входить 6 експозиційних розділів, присвячених різним аспектам та періодам розвитку української культури як на регіональному, так і національному рівнях. Музей історії НаУОА відвідується на рівні з усіма музейними закладами міста, є важливим науковим і навчальним центром університету та забезпечує збереження та популяризацію понад 1,5 тисячі експонатів.
